步骤

1.脲酶的提取：称取大豆粉1克，加入30%的乙醇25mL，充分摇匀后，置于冰箱中过夜，次日用2000rpm离心3分钟，取上清液备用。
2.标准曲线的制作：按下表加入各种试剂
单位：mL

立即摇匀各管，于460nm下比色，1号管为参比。
3.酶促反应速度的测定：按下表操作
                              单位：mL

管 号	尿素浓度	尿素加入量	磷酸缓冲液	保温时间	脲酶加入量	煮沸脲酶	保温时间	硫酸锌	蒸馏  氢氧 水   化钠
1 2 3 4 5	0.050 0.033 0.025 0.020 0.020	0.20 0.20 0.20 0.20 0.20	0.60 0.60 0.60 0.60 0.60	37度水浴保温5分钟	0.20 0.20 0.20 0.20 /	/ / / / 0.20	37度水浴保温10分钟	0.50 0.50 0.50 0.50 0.50	3.0      0.5 3.0      0.5 3.0      0.5 3.0      0.5 3.0      0.5

摇匀，静置5分钟后，于3000rpm离心5分钟，取上清液，供下步使用。
单位：mL

迅速混匀，于460nm处测吸光度，5号为参比
4.从标准曲线方程中脲酶作用于不同浓度尿素生成碳酸铵的量，然后以取单位时间碳酸铵生成量的倒数即1/V为纵坐标，以对应的尿素浓度的倒数即1/[S]为横坐标，应用最小二乘法公式，求出方程，计算Km值。