分子杂交技术
　　互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
　　杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
　　核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
第一节 核酸探针标记的方法
　　核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
　　一、双链DNA探针及其标记方法
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
　　1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
　　材料： 待标记的DNA。
　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
　　试剂：
　　(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
　　(2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。
　　(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
　　(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
　　(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。
　　(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
　　(7)10mol/L NH4Ac。
　　操作步骤:
　　(1) 按下列配比混合:
　　　　未标记的dNTP 10μl
　　　　10×切口平移缓冲液 5μl
　　　　待标记的DNA 1μg
　　　　[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
　　　　E.coli DNA聚合酶 4单位
　　　　DAN酶 I 1μl
　　　　加水至终体积 50μl
　　(2) 置于15℃水浴60分钟。
　　(3) 加入5μl EDTA终止反应。
　　(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
　　[注意] 1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
　　　　　2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。

　　2. 随机引物合成法 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
　　材料：待标记的DNA片段。
　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
　　试剂：
　　(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。
　　(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
　　(3)Klenow片段。
　　(4)20mmol/L DTT。
　　(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
　　(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
　　(7)缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。
　　操作步骤:
　　(1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。
　　(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:
　　　　20mmol/L DTT 1μl
　　　　未标记的dNTP溶液 1μl
　　　　10×随机标记缓冲液 1μl
　　　　[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
　　　　ddH2O 1μl
　　(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。
　　(4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。
　　(5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。
　　[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。
　　　　　2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。

　　二、单链DNA探针
　　用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。
　　1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
材料：已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。
　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
　　试剂：
　　(1)10×Klenow缓冲液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。
　　(2)0.1mol/L DTT溶液。
　　(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
　　(4)40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。
　　(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。
　　(6) Klenow片段（5单位/ml）。
　　(7)适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
　　(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。
　　操作步骤：
　　(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：
　　　　单链模板（约0.5pmol） 1mg
　　　　适当引物 5pmol
　　　　10×Klenow缓冲液 3ml
　　　　加水至 20ml
　　(2)将eppendorf管加热到85℃ 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；
　　(3)依次加入：
　　　　DTT 2ml
　　　　[a-32P]dATP 5ml
　　　　未标记的dATP 1ml
　　　　dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml
　　混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。
　　(4)加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。
　　(5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。
　　(6)68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。
　　(7)加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小时。
　　(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。
　　(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。
　　2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
　　反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料：已提纯的RN

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